تخلیص DNA

اگه میخوای مقاله رو بخونی برو به ادامه ی مطلب

  خلاصه مقاله :

پژوهشهای علمی در قلمرو دانش بشری ، طبیعتاً تحولاتی را ایجاب می کند و افقهای جدید و جالبی را برای دسترسی به فرآورده های بدیع و نو ، پیش روی جهانیان قرار داده است . یکی از این روشها ، واکنش زنجیره ای پلی مراز  PCR) ) می باشد که اولین بار در سال 1983 توسط مولیس ابداع گردید .

امروزه از PCR  در زمینه های مختلف پزشکی و دامپزشکی مخصوصاً تشخیص بیماریها از روی DNA عامل بیماریزا استفاده می گردد . برای شروع آزمایش PCR نیاز به DNA  عامل بیماریزا می باشد که این ماده ژنتیکی از نمونه های موجود ( خون ، بافت آلوده ، انگل ، اسکولکس ، جفت ، شیر ، عوامل بیماریزا و ... ) استخراج می گردد . نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی و تشخیصی ، جدا سازی DNA با درجه خلوص بالا می باشد . دستورالعمل استخراج DNA با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفاً استفاده از چند ماده انگاشته شود . درک عملکرد هر ماده این امکان را فراهم خواهد نمود که در صورت نبود یک ماده ، از ماده دیگری با کار مشابه استفاده کرد .  روشهای مختلفی جهت استخراج DNA وجود دارد که در این مقاله به روشهای کاربردی استخراج DNA از خون و نمونه بافتی  اشاره گردیده است .

ساختمان DNA

مقدمه :

پژوهش های علمی ، در قلمرو مختلف دانش بشری طبیعتاً تحولاتی را ایجاب می کند و افقهای جدید و جالبی را برای دسترسی به فرآورده های بدیع و نو پیش روی جهانیان قرار می دهد . امروزه تکنیک های جدید حاصل از مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی به تدریج جایگزین روشهای سنتی و متداول گردیده اند . یکــی از روشهـــای نـــوین و دقیق که امروزه کاربرد فراوانی پیدا کرده است واکنش زنجیری پلی مراز ( PCR= Polymerase Chain Reaction )  می باشد که در سال 1983 اولین بار توسط Mullis  ابداع و در سال 1985 اولین مقاله کاربردی آن نوشته شد . با این کشف ، بیولوژی مولکولی دچار تغییر و تحول گردید و تحقیقات پزشکی و دامپزشکی و بیولوژی در خصوص آن و DNA  به سرعت افزایش یافت . ویژگیهای و خصوصیات زیاد این تکنیک از جمله سرعت و دقت بالای آن در تشخیص عوامل بیماریزا در مقایسه با روشهای معمول و متداول مورد استفاده در آزمایشگاهها ، باعث گردیده است تا محققین به تدریج آن را جایگزین روشهای سنتی نمایند . امروزه در بسیاری از مراکز تحقیقاتی و تشخیصی از این روش برای تشخیص ارگانیسمهای مختلف ( باکتری ها ، ویروسها ، انگلها و قارچها ) استفاده می گردد . با این روش ما می توانیم هر ژنی را از هر میکروارگانیسم زنده ای جدا کنیم .  از PCR  در زمینه های مختلف از قبیل تعیین خصوصیات ژنها ، کلونینگ ، تشخیص پاتوژنها از روی DNA  عوامل بیماریزا ، تشخیص بیماریهای ژنتیکی قبل از تولد ، تعیین جنسیت جنین ، تشخیص سرطانها و تعیین هویت افراد استفاده می گردد . این روش هم اکنون به عنوان یک روش آزمایشگاهی تحقیقاتی و تشخیصی مطرح شده است  ( 8 ) .  در سال 1985 فقط 38 گزارش کار عملی و در سال 1986 ، فقط 91 گزارش عملی در زمینه PCR  وجود داشته در حالیکه در سال 1999 حدود 160000 مقاله علمی در این خصوص به چاپ رسیده است .

PCR یک روش آزمایشگاهی خارج از بدن می باشد که قطعه خاصی از   DNA  ( قطعه بین دو توالی DNA  ) را تکثیر می کند . لذا برای انجام آزمایش PCR  نیاز به مولکول دو رشته ای   DNA  داریم که این مولکول باید از نمونه های موجود ( خون ، بافت ، انگل ، اسکولکس ، جفت ، عوامل بیماریزا و … )  استخراج  گردد . همچنین از DNA  تهیه شده می توان در آینده در ساخت واکسنهای DNA استفاده نمود .  روش های آزمایشگاهی مختلفی جهت تخلیص DNA  موجود می باشد.

ساختمان DNA  :

در سال 1953 ساختمان مارپیچ دو رشته ای DNA  توسط واتسون و کریک مشخص شد و کلیه خصوصیات DNA  در حد مولکول قابل تفسیر گردید و اثر مواد موتاژن ( جهش زا ) در DNA   نیز معلوم گردید . DNA  مسئول توارث است و ترتیب اسید آمینه را در پروتئین تنظیم می کند . مهمترین خصوصیت DNA  ساختمان مارپیچ دو رشته ای آن است که در دو رشته پلیمری باریک و بسیار طولانی مانند طناب دور هم پیچیده اند تشکیل شده است . قطر مارپیچ در حدود 20 آنگستروم و در هر 34 آنگستروم یک دور کامل می زند . هر زنجیره از تعداد بیشماری نوکلئوتید که به هم متصل شده است ساخته شده است . هر نوکلئوتید در DNA  از یک قند 5 کربنه دی اکسی ریبوز ، یک باز ( پورین یا پیریمیدین ) و یک گروه فسفر تشکیل شده است . که قند به ریشه فسفات نوکلئوتید بعدی متصل می شود . در حقیقت ستون فقرات زنجیره DNA  را قند دی اکسی ریبوز و گروه فسفات می سازد که در تمام نوکلئوتیدها یکسان می باشد . حلقه 5 کربنه قند را 1 تا 5 نامگذاری می کنند تا با حلقه های باز اشتباه نشود .

دو زنجیر به وسیله پیوندهای هیدروژنی متعدد که بین بازها ایجاد می شود به هم متصل می شوند . آنچه در این ساختمان مهم است این است که بازهای آدنین مقابل تیمین با دو پیوند هیدروژنی ( A = T ) . بازهای سیتوزینی مقابل گوانین با سه پیوند هیدورژنی ( C = G )  قرار دارد . بدین صورت یک باز پوزین ( آدنین و گوانین ) در مقابل یک باز پیریمیدین ( تیمین و سیتوزین ) در زنجیره دیگر قرار می گیرد و مارپیچ منظمی را به وجــود مــی آورند . اگر DNA  را تا حدود 100 درجه سانتی گراد حرارت دهیم پیوندهای هیدروژنی شکسته می شود و دو رشتــه از هم جدا می شوند . در صورتی که مجدداً سرد شوند هر رشته جفت و مکمل خود را پیدا می کند و پیوندهای هیدروژنی بین آنها به وجود می آید و رشته های مارپیچ دوباره تشکیل می شود . دو اختلاف در رشته های DNA  و  RNA  وجود دارد که یکی مربوط به قند آنهاست که قند در DNA  دی اکسید ریبوز است ولی RNA  ریبوز می باشد و دیگری اختلاف در باز می باشد که در رشته RNA    باز اوراسیل در مقابل آدنین قرار می گیرد ( U = A  ) اما در DNA  باز تیمین در مقابل آدنین قرار می گیرد .

روشهای تخلیص ( استخراج ) DNA    :

نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی ضرورت جداسازی DNA  با کیفیت عالی است . معمولاً کیفیت DNA  با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA  ، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می کنند سنجیده می شود ( 1 و 2 ) . به علت بزرگ بوده اندازه مولکول DNA  ، روشهای استخراجی باید حداقل استرس مکانیکی را در طی مراحل استخراج ایجاد نماید . معمولاً روشهایی که در آنها چندین شوینده همچون  SDS و TRITON X100  استفاده میشود که نقش آنها لیز نمودن سلول و کمک به از بین بردن پروتئین متصل به DNA  می باشد . پروتئین زدایی بیشتر از طریق پروتئناز K  صورت می گیرد که این ماده در بافر لیز کننده مورد استفاده قرار می گیرد ( 2 ) . این آنزیم در حضور SDS  در دمای 65-56 درجه سانتیگراد فعالیت دارد. تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت می شود . برعکس در همین شرایط آنزیمهای دیگری مثل DNAase  دناتوره می شود . متعاقب استفاده از پروتئیناز K  ایزوپروپانول برای از بین بردن مؤثر پروتئین ها استفاده می شود . و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز به طور مؤثر از طریق کاربرد فنل و کلروفرم از بین می رود . آلودگی RNA  از طریق تیمار کردن نمونه با RNAase  از بین می رود . در روشهای دیگر بعد از پروتئیناز از نمک اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده می شود . در استخراج DNA بهتر است از هپارین استفاده نشود چون هپارین فعالیت Taq پلی مراز جلوگیری می کند . وجود EDTA  به میزان حداقل 2 Mm  در بافر استخراج باعث می شود که کوانزیمهای DNAase  با  EDTA  شلات می شود و از تجزیه تصادفی DNA جلوگیری نماید ( 1 و 2 و 3 ) .

شیوه هایی که جهت خالص سازی DNA  مورد استفاده قرار می گیرد علاوه بر برخورداری از حداقل زمان و سرعت بالا ، روش مطمئنی جهت حذف ممانعت کننده ها (  inhibiators ) و خالص نموده کلیه اسید های نوکلئیک نیز باشد . این ممانعت کننده ها گوناگون بوده و می توانند در ارتباط به نوع نمونه متفاوت باشند . در صورتیکه خالص نمودن DNA  در نمونه از کیفیت پایینی برخوردار باشد ، بواسطه اثر مهار کنندگی مواد موجود در نمونه ها و یا مواد استفاده شده در مراحل خالص سازی ، بر فعالیت پلیمراز اثر گذاشته و نتیجه تست منفی کاذب خواهد گردید .

دستورالعمل استخراج DNA  با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفاً استفاده از چند ماده انگاشته شود . درک عملکرد هر ماده این امکان را فراهم خواهد نمود که در صورت نبود یک ماده ، از ماده دیگری با کار مشابه استفاده کرد . روشهای مختلفی برای تخلیص DNA   وجود دارد که در اینجا به چند روش برای تخلیص DNA   از خون و نمونه های بافتی می پردازیم .

1 – تخلیص DNA   از خون :

بــرای تخلیـص DNA   از گلبولهای سفید خون استفاده می شود . برای این کار چندین روش از جمله روش فنل – کلروفرم ، روش پروتئیناز K  ، روش جوشاندن ، روش اسید – گوانیدیوم – فنل – کلروفرم ( AGPC ) و … استفاده می شود که در اینجا دو روش پروتئیناز K  و روش جوشاندن به علت کم هزینه بودن آنها شرح داده می شود .

( 1 – 1 ) روش جوشاندن :

مواد مورد نیاز :

1 – بافر لیز کننده گلبولهای قرمز ( بافر R ) : که شامل مواد زیر می باشد :

- باز تریس                  با PH = 7/5           10 میلی مولار

- ساکارز                                              32%  مولار

- کلرید منیزیم ( MgCl 2  )        10 میلی مولار یا 5 میلی مولار

- تریتون 100X                                          1%

مخلوط کرده و حجم را با آب مقطر به 50 میلی لیتر می رسانیم .

2 – محلول ( I ) : هیدروکسید سدیم ( NaOH  ) 50 میلی مولار

3 – محلول ( II  ) . باز تریس             یک مولار

روش کار:نیـم میلی لیتر خون فاقد هپارین را در میکروتیوب ریخته و به آن یک میلی لیتر بافر R اضافه می کنیم و خوب مخلوط می کنیم . سپس به مدت دو دقیقه با شدت 1000 دور در دقیقه آنرا سانتریفوژ می کنیم . بعد محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیزشده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود 200 میکرو لیتر بافر R به میکروتیوب اضافه کرده و هم می زنیم تا رسوب موجود در میکروتیوب به رنگ سفید در آید و مجدداً با شدت1000دور در دقیقه سانتریفوژ می کنیم . این عمل را تا تهیه رسوب کاملاً سفید ادامه می دهیم . در مرحله بعد 100 میکرولیتر محلول(I) بر روی رسوب ریخته و آنقدر هم می زنیم تا رسوب حل شود . سپس میکرو تیوبها را به مدت 20 دقیقــه در آب جــوش قــرار داده تا گلبولهای سفید لیز شوند . در آخرین مرحله 20 میکـرولـیتر محـلول (II) را بـه میکروتیوپ اضافه می کنیــم . ( ایــن محلول باعث نگهداری و حفاظت DNA در محلول می شود) و هم می زنیم و سپس به مدت 30-20 ثانیه با دور 1000 سانتریفوژ می کنیم و در نهایت محلول رویی که حاوی DNA می باشد با احتیاط به یک میکروتیوپ جدید منتقل می کنیم . سپس با اتانل مطلق DNA  را رسوب می دهیم.

بحث :

روش جوشاندن دارای معایب و محاسن متعددی است . این روش اصولاً دارای مرحله ای تحت عنوان خالص سازی نمی باشد ، بلکه توانایی آن تنها از این نظر مهم میباشد که میتواند DNA  را در دسترس قرار دهد . علاوه بر این مواد مصرفی در این روش کمتر بوده و در زمان کوتاه امکان کار با نمونه های انبوه وجود داشته و آلودگی در آزمایشگاه نیز کمتر خواهد بود . از معایب این روش هم عدم حذف کامل مهار کننده ها می باشد و دیگر اینکه روش جوشاندن قادر به استفاده نمونه های با مقادیر کم DNA  نمی باشد . با وجود معایب متعدد آن بواسطه سرعت مطلوب این روش در بسیاری از آزمایشگاههای تشخیص طبی که از PCR  استفاده می گردد برای آماده نمودن  DNA از آن استفاده می نمایند( 7 ) .  با استفاده ازاین روش می توان به آسانی از خون تازه ، لخته شده ، کهنه و خشک و همچنین عوامل بیماریزا  DNA را استخراج کرد.

( 2 – 1 ) روش پروتئیناز K :

مواد مورد نیاز :

1 – بافر لیزکننده گلبولهای قرمز ( بافر R )

2 – بافرP  که شامل مواد زیر می باشد :

- اتیلن دی آمین تترااستیک اسید ( EDTA )   با 2/8 = PH  2 میلی مولار

- باز تریس         10 میلی مولار

- کلرید سدیم ( NaCl  )      44% مولار

3 – محلول S  : سدیم دودسیل سولفات ( SDS )   10%

4 – محلول N  : کلرید سدیم ( NaCl  )     4 مولار

5 – محلول TE  که شامل مواد زیر می باشد :

- EDTA  با    8 = PH           1 میلی مولار

- باز تریس با     6/7 = PH          10 میلی مولار

6 – پروتئیناز K   : از این آنزیم با غلظت 20 میلی گرم در میلی لیتر ( mg/ml  20 ) استفاده می شود که پروتئینهای هیستونی و غیر هیستونی در DNA   را تخریب می کند . این آنزیم در دمای 55 درجه سانتی گراد بهترین فعالیت را دارا می باشد .

7 – اتانل مطلق و اتانل 70 درصد

روش کار :

نیــم میلی لیتر خون را در یک میکروتیوب ریخته و برای لیز کردن گلبولهای قرمز به آن به میزان یک میلی لیتر بافر R  اضافه می کنیم خوب مخلوط کرده و با دور xg 1000  به مدت 2 دقیقه سانتریفوژ انجام می گردد . پس از سانتریفوژ ، محلول رویی که حاوی گلبولهای قرمز لیز شده و پلاسمای خون می باشد را دور ریخته و مجدداً حدود 500-200 میکرولیتر بافر R  به میکروتیوب اضافه می کنیم و بعد سانتریفوژ انجام می گیرد . این کار را تا به دست آوردن رسوب سفیــد رنگ در میکروتیــوب ادامــه می دهیــم . پس از تهیه رسوب سفید ، 300 میکرولیتر بافر P  به منظور لیز کردن گلبــولهای سفید به مبکروتیوب اضافه می کنیم و پس از هم زدن ، به میزان 20 میکرولیتر محلول S  ( جهت دناتوره کردن پروتئینها ) به میکروتیوب اضافه می کنیم و آنقدر هم می زنیم تا رسوب کاملاً حل گردد . بعد به میزان 5 میکرولیتر از آنزیم پروتئیناز K ( mg/ml  20 ) به میکروتیوب اضافه کرده و خوب حل می کنیم . سپس میکروتیوبها در دمای 55 درجه سانتی گراد و به مدت یک ساعت انکوبه می شوند ( در طول شب در دمای 37 درجه نیز قرار داده می شود . ) بایستی هر 5 دقیقه یکبار محتویات میکروتیوب را هم زد . پس از گذشت این زمان ، صد میکرولیتر محلول   N  به لوله اضافه شده و به طور مختصر هم می زنیم و بعد به مدت 30 – 10 دقیقه در یخ قرار داده تا حالت ابری ( به علت رسوب پروتئینها ) در محلول داخل میکروتیوب مشاهده شود . میکروتیوب را به مدت 10 دقیقه با دور xg  1000 سانتریفوژ می کنیم و محلول شفاف رویی با احتیاط به میکروتیوبهای جدید منتقل می شود . ( رسوب موجود حاوی پروتئینهای دناتوره می باشد . ) به محلول رویی جدا شده یک میلی لیتر اتانول مطلق سرد اضــافه شــده و بــه آرامــی هــم می زنیم . تا کلافهای شیری رنگ DNA  مشاهده شود . سپس مدت 10 دقیقه با دور xg  1000  سانتریفوژ نموده و محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب ( مولکولهای DNA  ) باقی مانده صد میکرولیتر اتانل 70 درصد ریخته ( جهت شستشو ) و خوب هم می زنیم و سپس برای مدت 2 دقیقه با دور xg  1000 سانتریفوژ می کنیم . محلول رویی را دور ریخته و میکروتیوبها را به کمک حرارت در زیر هود و درجه حرارت اتانل خشک می کنیم و سپس به هر یک از میکروتیوبها 100 میکرولیتر بافر TE  یا آب مقطر بدون یون اضافه کرده و به آرامی به هم زده تا رسوب DNA  حل شود . برای حل شدن بهتر DNA  می تونا از حرارت 60 درجه ســـانتی گراد حمام بخار آب جوش استفاده می شود.

2 – تخلیص DNA  از نمونه بافتی ( کرم ، اسکولکس ، جفت و … ) :

روشهای مختلفی از قبیل آنزیم تریپین ، روش جوشاندن ، روش اسید گوانیدیم فنل کلروفرم ( AGPC ) ، روش  IRIzol  وجود دارد که در اینجا به شرح چند روش می پردازیم :

روش ایرایزول IRIzol روشی بسیار بدیع و کاملا ایرانی است که محصول شرکت زیست فناوران رنا است. این کیت یک مرحله ای بوده و بر روی تمام وجودات زنده و مرده منجر به استخراج DNA  شده است.

روش تخلیص DNA  از ایرایزول ( IRIzoL  ) ساخت شرکت زیست فناوران رنا :

این کیت بصورت تجاری موجود میباشد

روش کار :

مرحله ( 1 ) : تهیه پلیت DNA  از بافت :

100 – 50 میلی گرم نمونه بافتی ( کرم یا اسکولکس, گیاه......... ) را در داخل هموژنیزر یا یک هاون کوچک قرار داده و نمونه را کاملاً خرد می نمائیم ( بهتر است ابتدا با قیچی نمونه به قطعات کوچک تقسیم نمود . )‌ میتوان نمونه های بافت را در هاون ساییده شود  . سپس به آن یک میلی لیتر ایرایزول اضافه نموده و خوب مخلوط می کنیم و آن را داخل میکروتیوب ریخته و برای مدت 5 دقیقه نمونه هموژنیزه شده را در دمای محیط به مدت 5 دقیقه قرار می دهیم تا خروج DNA به داخل بافر صورت گیرد . سپس به آن به اضاء هر میلی لیتر ایرایزول 200  میکرولیتر کلروفرم اضـافه نموده وآنها را به شدت برای 15 ثانیه با دست تکان داده و برای مدت 5 – 2 دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم و سپس مخلوط میکس را با دور    11000 برای مدت 10 دقیقه سانتریفوژ می کنیم  . سپس سه فاز در میکروتیوب در میکروتیوب ایجاد می شود . فاز پایینی قرمز ، فاز وسط حاوی پروتئین و فاز بالایی بی رنگ  که حاوی DNA می باشد  .تمام فاز بالایی را به دقت خارج کرده و آن را در داخل تیوپ جدید قرار می دهیم . سپس با اندازه حجو آن 1/5 برابر اتانول 100 درصد اضافه میکنیم و  نمونه را به مدت 5 دقیقه در دمای 20 –  درجه سانتی گراد قرار می دهیم تا DNA ته نشین گردد . سپس به مدت 5 دقیقه با دور 11000 سانتریفوژ پلیت DNA  در ته میکروتیوب تشکیل میگردد. سپس مایع رویی را دور ریخته و به تیوپ اتانول 80% اضافه میکنید و پروسه شستشو  به اتمام برسد. در پایان پس از انجام یک بار سانتریفیوژ  دیگر مثل مرحله قبل اتانول 80% از تیوپ خارج شده و پلیت DNA در 50 -100 میکرولیتر آب دوبار تقطیر استریل محلول میگردد.

تعیین غلظت DNA تخلیص شده :

بعد از تخلیص DNA با استفاده از روشهای مختلف باید غلظت DNA بدست آمده را تعیین کرد. برای این منظور از دو روش استفاده می شود :1) روش الکتروفورز           2) روش اسپکتوفتومتری

1 – روش الکتروفورز :

در این روش نمونه DNA ی تخلیص شده را همراه با شناساگرهایی ( مارکر ) که غلظت آنها مشخص است الکتروفورز کرده و با مقایسه باندهای ایجاد شده مربوطه به DNA  تخلیص شده با باند مارکر می توان به طور کیفی مقدار DNA  را مشخص کرد . برای این منظور 5 میکرولیتر از محلول DNA  را به همراه یک میکرولیتر بافر بارگیری بــر روی ژل آگار 8/0 درصــد نمونــه گذاری کرده و الکتروفورز می شود . برای دیدن باند DNA  بایستی ژل را به مدت 5 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید ( mg/ml  5/0 ) قرار داده و بعد در زیر نور ماوراء بنفش بر روی دستگاه UV-transiliuminator  مشاهده کرد ( و یا می توان اتیدیوم بروماید را در زمان تهیه به ژن اضافه کرد . )

طرز تهیه ژل الکتروفورز :

برای تهیه ژل الکتروفورز از چندین بافر استفاده می شود که عبارتند از :

1 ) Tris – acetate  ( TAE )

2 ) Tris – phosphate  ( TPE )

3 ) Tris – borate  ( TBE )

4 ) Alkaline

معمولاً بافر TAE  بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد .

طرز تهیه :

تهیـــه ژل بستگی به نوع الکتروفورز ، حجم مورد نیاز و اندازه مولکول DNA  دارد . ابتدا مقداری آگارز را وزن کرده و در مقداری از TAE  حل می کنیم . برای مثال اگر بخواهیم 50 میلی لیتر ژل 2% تهیه کنیم یک گرم آگارز را در 50 میلی لیتر TAE  حل می کینم ( در داخل ارلن مایر 100 میلی لیتری ) و آنرا در ماکروویو در درجه حرارت متوسط برای مدت یک دقیقه قرار داده تا آگارز در آب مقطر حل شود و کاملاً شفاف گردد . ( در صورت نبودن ماکروویو از بن ماری آب جوش استفاده می کنیم . ) بعد از این مدت می گذاریم تا درجه حرارت محلول پایین و حدود 70 درجه سانتی گراد بیاید و سپس به آن 10 میکرولیتر اتیدیوم بروماید mg/ml  1 اضافه می کنیــم ( ایــن ماده بسیار سرطانزا می باشد و باید با دستکش کار کرد و برای رنگ آمیزی DNA  بکار برده می شود . ) محلول را خوب هم زده و در داخل ظروف مخصوص ژل می ریزیم و نشانه محلول را در داخل آن قرار می دهیم ، صبر می کنیم تا ژن کاملاً سفت شود سپس نشانه را برداشته و حفره هایی تشکیل می شود که این حفره ها محل دود کردن ( Louding )  ( بارگیری ) DNA  می باشد . برای این کار ژل را داخل الکتروفورز قرار داده و داخل آن را مقداری ( حدود 50 میلی لیتر ) TAE  اضافه کرده تا سطح ژل را کاملاً بپوشاند سپس به وسیله یک میکروپیپت 8  میکرولیتر DNA  را با دو میکرولیتر Louding dye   بر روی یک پارا فیلم مخلوط کرده و سپس آن را به وسیله از روی پارا فیلم برداشته داخل حفره ژل Loud  می کنیم به این ترتیب نمونه ها را قرار داده و 10 میکرولیتر مارکر را در وسط ژل و یا در دو طرف Loud  می کنند و سپس جریان الکتروفورز را به سرعت ، با ولتاژ 70 میلــی ولـــت بـــرقـــرار نموده ، پس از یک ساعت ژل را بر روی UV-Transilluminater    قرار داده و باندهای DNA  را مشاهده می کنیم .

طرز تهیه Gel-Louding dye  :

برای تهیه این ژل از موادی چون فیکول ، EDTA  ، برموفنل بلو و گزیلول سیانول استفاده می شود. برای تهیه 5 میلی لیتر از این ژل حدود 1 میلی گرم فیکول ، 250 میکرولیتر EDTA  5/0 مولار 50 میکرولیتر برموفنل بلو 5 درصد و 50 میکرولیتر گزیلول سیانول 03/0 درصد استفاده می شود . این ژل به طور تجاری نیز وجود دارد  .

2 – روش اسپکتوفتومتری :

این روش مهمترین روشی  است که برای تعیین غلظت DNA  تخلیص شده استفاده می شود . این روش یک روش کمی بوده و می توان غلظت DNA  را با استفاده از جذب نوری در طول موج 260 نانومتر از طریق فرمول زیر محاسبه کرد :

100 × 50 × جذب در 260 نانومتر = غلظت DNA  بر حسب میکرو گرم بر میلی لیتر

جذب برای یک OD  در 260 نانومتر نشان دهنده وجوشد 50 میکروگرم در میلی لیتر DNA  دو رشته ای در محلول می باشــد . بــا استفاده از این روش می توان مقدار ناخالصی ناشی از حضور پروتئین را در محلول DNA  تعیین نمود. برای این منظور جذب را بایستی یکبار در طول موج 260 نانومتر ( طول موجی که در آن DNA  حداکثر جذب را دارد ) و بار دیگر در طول موج 280 نانومتر ( که پروتئین حداکثر جذب را دارد ) اندازه گرفت و با استفاده از نسبت جذب در 260 نانومتر به جذب در 280 نانومتر مقدار ناخالصی را محاسبه کرد . هر چه این نسبت از 8/1 کمتر باشد شدت آلودگی DNA  به پروتئین بیشتر است . اگر ناخالصی زیاد باشد ( نسبت حدود 3/1 باشد ) بهتر است از آنزیم پروتئیناز  K  استفاده گردد .